用于选择性背景噪声抑制的频域STED显微镜

科技
2022-07-14
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       据《先进光子学》报道,浙江大学的研究人员近日提出了一种新的显微技术,可以选择性地抑制现有受激发射损耗 (STED) 显微镜技术中的背景噪声。该方法有效地避免了 STED 成像中传统噪声抑制方法的局限性。

 

       受激发射耗尽(STED)显微技术是由Stefan W. Hell和Jan Wichmann于1994年开发的,并于1999年由Hell和Thomas Klar实验证明,是一种用于纳米显微镜的超分辨率技术,其开发者并因此于 2014 年获得了诺贝尔化学奖。 尽管STED显微镜技术已经取得了长足的进步,并被广泛应用于实际研究中。但在200 到 300 nm 的纳米技术实际应用中,仍会产生对空间分辨率和图像质量具有负面影响的不良背景噪声。一般来说,这种噪声来自两个信号源:耗尽束的超高光剂量引起的再激发产生的荧光,以及抑制束耗尽不足引起的残留荧光。

 

       尽管目前已经开发了多种背景去噪方法,但它们在实际应用中也存在某些缺点,包括图像失真、长时间采集或引入散粒噪声等。

 

       现有的背景噪声去除方法可以分为三类:时域、空间域和相量域。

 

图:频域 STED 显微方法,可以选择性地抑制 STED 成像中的背景。

 

       因此,研究团队提出了一种称之为“双调制差”STED(dmdSTED)的方法,可以有选择性地抑制背景噪声。该方法的工作原理是将空间域信号分选道频域,以便将未耗尽的荧光和 STED 诱导的背景与所需的荧光信号分离开来。激发光束和耗尽光束分别加载不同的时域调制。由于dmdSTED避免了耗尽光束引起的再激发,因此可以选择波长更接近样品荧光发射光谱峰值的耗尽激光,从而降低了所需的耗尽强度。

 

       当前 dmdSTED 方法的空间分辨率为 λ/8,比容易产生散粒噪声的相角域方法的分辨率更高。研究人员表示从理论上讲,该方法可以避免由时域方法(例如时间门控)引起的潜在信号损耗。此外,dmdSTED 与脉冲或连续波兼容,并且不需要使用时间相关单光子计数的硬件。相比空间域方法,dmdSTED 的时间分辨率不受限制。因此,dmdSTED 在空间分辨率、信噪比和时间分辨率等方面获取综合精细的显微图像具有优势。

 

       据现代光学仪器国家重点实验室主任、该研究的资深作者刘旭介绍,频域方法有潜力集成到其他双光束点扫描技术中,比如激发态饱和显微镜、电荷状态耗尽显微镜和基态耗尽显微镜等。此外,该方法可以接受更多类型的样品,这些样品的光谱特性不同于 STED 成像中常用的荧光染料,比如激发光谱更宽的量子点。

 

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